人皮肤单细胞转录组分析鉴定特应性皮炎中新型成纤维细胞亚群及免疫亚群的富集 | 单细胞专题

文章基本信息

标题：Single-cell Transcriptome Analysis of Human Skin Identifies Novel Fibroblast Subpopulation and Enrichment of Immune Subsets in Atopic Dermatitis

题目：人皮肤单细胞转录组分析鉴定特应性皮炎中新型成纤维细胞亚群及免疫亚群的富集

发表杂志：Journal of Allergy and Clinical Immunology 

影响因子：14.11

样本类型：5例AD患者、7例对照组

研究方法：10XGenomics单细胞转录组测序，免疫组化染色

研究背景

特应性皮炎(Atopic dermatitis，AD)是一种常见的皮肤炎症性疾病，AD涉及皮肤免疫和屏障异常，包括T细胞和树突状细胞(DC)浸润、表皮增生和角化细胞分化紊乱。AD的主要特征是2型免疫反应，但不同程度疾病也可能涉及1型、17型免疫反应和22条不同通路。在中度至重度AD患者中，涉及到>10%的体表面积，这些异常延伸到明显受影响的皮肤之外，也涉及到非损伤性皮肤。

直到最近，针对AD的皮肤特征描述仅仅是基于皮肤组织活检的特征，使用转录组测序和芯片检测开展。虽然整个皮肤活检提供了有关细胞因子的重要信息，但它们并没有很好地定义原始细胞类型。单细胞rna测序(scRNA-seq)提供了一种新的方法来定义皮肤中的细胞组成，包括新的或罕见的细胞群体，并能够解决AD与对照组中细胞特异性基因表达的变化。本文利用10XGenomics单细胞测序技术，采集了5名AD患者 (4 lesional samples, 5 non-lesional samples)和 7名健康对照者的皮肤活检样本，从中分离出39042个单细胞进行转录组测序。构建了健康、非损伤和损伤性AD皮肤中所有细胞类型的综合图谱，揭示了细胞的不同组成和特异性基因表达的变化，以及一种新的炎症成纤维细胞亚群，可能与T cell迁移/转运和2型免疫反应有关。最后，作者为每种细胞类型鉴定了大量表达的受体和配体，以突出皮肤微环境中的细胞间通讯。

研究内容

1. 健康、非损伤和损伤皮肤的单细胞图谱

作者为探讨AD和健康人皮肤的单细胞分布特征，分离5例AD患者和7例健康对照组的冷冻保存皮肤活检组织后制备的细胞悬液，利用10XGenomics技术平台获得单细胞。然后利用CellRanger和Seurat软件进行数据分析，分别从健康、损伤性AD和非损伤性AD样本中鉴定出22220、10169和6653个高质量的scRNA的图谱特征，包括角质形成细胞（KC1-3）、成纤维细胞（FB1-3）、周细胞和血管平滑肌细胞（PC-vSMC）、黑素细胞（MEL）、神经元和施万细胞（NC-SC）、汗腺细胞（SGC）、血管内皮细胞（VEC1-2），淋巴内皮细胞（LEC）、巨噬细胞和树突状细胞（MAC-DC）和T细胞（TC）10种细胞类型(图1C-D)。作者确定了所有样本中每种细胞类型的相对比例，显示与对照组相比，损伤性AD的免疫细胞增加。

作者将一级tSNE聚类结果按照每种细胞进一步进行分析，比如KCs的3个亚群，二级tSNE分为7个亚群，即基底、增殖、基底上、内根鞘-皮脂腺、外根鞘、通道ATPase和通道间隙（图2A），然后分析了每个亚群的高表达基因情况。为了评估来自冷冻保存和新鲜样品的细胞质量，从一名健康志愿者身上进行了额外的新鲜活组织检查，并进行了相同的分析，揭示了绝大多数由KC（占所有细胞的92%）组成的细胞类型。

2. 新型炎性COL6A5 + COL18A1+成纤维细胞亚群在特应性皮炎病变中的应用

大多数cluster，包括成纤维细胞，分布在所有样本中。然而，COL6A5+COL18A1+ FBs主要由损伤性AD细胞组成（图3A）。这些FBs表达炎症细胞因子（CCL2，CCL19，IL32）和由2型炎症（POSTN，TNC，VCAM1）诱导的ECM产物（图3B）。所有的损伤性AD样本都显示COL6A5+COL18A1+FBs的扩增，而之前对健康成纤维细胞的研究没有报道。FBs的DEG分析表明，在模型系统中，POSTN、S100基因（S100A10、S100A11）和CRIP1（一种锌指）可诱导2型细胞因子的产生，CCL26可能是dupilumab对2型靶向反应的最佳标记物，lesional PC高度表达CCL2、CCL19和CCL26。为了验证和确定这些COL6A5 + COL18A1 + FB的解剖位置，我们进行了免疫组织化学染色，并用了代表标记物的细胞计数（图3G）。与对照相比，在病变和非病变AD中，COL6A5 +细胞均显着增加，最明显的是在表皮-表皮交界处的上层真皮中。与非病变皮肤和对照相比，AD病变显示CCL2 +细胞浸润增加，CCL19和POSTN的趋势相似。免疫荧光染色进一步证实了AD病变上部真皮中的COL6A5 + CCL19 +和COL6A5 + POSTN +双重染色，可能是由成纤维细胞引起的（图3H）。

3. 特应性皮炎角质形成细胞和其他非免疫细胞类型的组成差异及差异表达基因

作者选择KC亚群进一步进行亚聚类，以便详细地分析稀有亚群。TOP2A+UBE2C+增殖KC簇分为KC.proliferating.1（表达MGST1、APOE、KRT17）和KC.proliferating.2（KRT1、CCL27）（图4A）。KC.proliferating.1可能是毛囊中快速分裂的细胞，主要含有健康细胞，而KC.proliferating.2则由损伤性AD细胞组成。基底上KCs分解为两个KRT1+KRT10+亚群，其中一个亚群主要由损伤性AD细胞和表达角蛋白，在高增殖和伤口愈合状态下富集（KRT6、KRT6A、KRT16），与表皮增生相一致（图4B）。

损伤性AD-KCs中明显的表皮增生与表皮增生相关基因的表达增加一致，包括S100（S100A7，S100A8，S100A9）和蛋白酶抑制剂（SERPINB4）基因。与对照组相比，2型趋化因子CCL2显著上调，CCL27是T细胞募集所必需的，可引起过敏原特异性皮肤炎症。使用DAVID功能注释工具进行的通路富集分析显示，损伤性AD-KCs富含表皮发育、免疫反应和伤口愈合反应等功能，而健康KCs则富含细胞分化的负调节、生长的调节，以及脂质代谢过程的调节。

4. 特应性皮炎中LAMP3+CCR7+及其他树突状细胞亚群的鉴定

健康人皮肤中的主要DC亚群包括表皮朗格汉斯细胞（LC）和真皮常规DC（cDCs），进一步细分为1型（cDC1）和2型（cDC2）亚群。DC.A和DC.B被组合并进一步分解为三个簇（图5A）。最大的亚群组CD1C最高，CD11C/ITGAX和CD207/langerin也特异性表达，与cDC2和LC簇（cdc2lc）相一致。第二个簇高度表达cDC1标记CLEC9A和IRF8。最后，2型趋化因子CCL17和CCL22以及CCL19受体CCR7的高表达使主要表达LAMP3（成熟DC的标志物，主要由病变AD细胞组成）的重要种群得以区分（图5A-B）。cDC2（CD11C+）、LAMP3+CCR7+DCs，以及CD68+MACs在lesional AD中较对照组有扩增（图5C）。基于特征标记计算先前在皮肤中发现但由于其稀有性而无法通过聚类解决的其他DC子集的比例频率（图5D）。炎症性树突状表皮细胞（IDEC）CD1A+FCER1A+是AD的特异性细胞，与其他DC亚群相比，其在AD中的表达增加，BDCA3+DCs和BDCA2+浆细胞样DCs在AD中的表达也略高于对照组（图5D）。损伤性AD-MAC-DCs表达的2型趋化因子CCL13和CCL18增加（图5E-F）。

5. 特应性皮炎中的细胞间通讯

为了研究细胞类型之间潜在的细胞间通讯，作者筛选了在lesional AD和对照组中差异表达的配体及其同源受体的平均表达水平（图6）。在AD病变中，炎症性COL6A5+COL18A1+FB亚群产生的CCL19与TCs和MAC-DCs上的CCR7，特别是LAMP3+DCs的相互作用，对调节淋巴细胞的组织和转运至关重要。2型趋化因子CCL2在炎症性FBs和KCs中大量表达，其受体CCR1和CCR2在MAC-DCs中表达。损伤的TCs在FBs和PC-vSMCs上高表达关键的2型细胞因子IL13，通过IL4R和IL13RA1进行信号转导。CCL27在受损的KCs中上调，提示TCs通过CCR10信号传导，突出了主要“非免疫”（如FBs、KCs）和免疫细胞之间的通讯。

文章总结

本文首次对AD患者与健康对照组的所有细胞类型和表达进行全面、高分辨率的单细胞转录组分析，得到10种广泛的细胞类型。其中FB亚群是AD病变特有的，含有高表达的COL6A5和COL18A1。COL6A5被认为是一个AD易感基因，在AD中的致病作用可能是由于形成不稳定的异三聚体导致异常的成纤维细胞粘附、胶原合成和代谢以及屏障破坏，COL18A1/endostatin通过调节LCs和T细胞可能促进过敏原的敏化和炎症。作者提供了一个详细的分子图，显示了各种细胞类型和潜在的相互作用，这些相互作用参与了AD特异性炎症和屏障的改变。本研究是第一个定义AD皮肤中成纤维细胞和极化T细胞对组成型细胞因子激活的单细胞转录组，表明这些炎症产物是潜在的治疗靶标。在炎性皮肤病的临床试验中，单细胞分析可用于评估治疗反应。但是本研究具有一定的局限性，作者无法恢复某些表达晚期分化标记（例如FLG）的角质层细胞等KC种群，这可能归因于冷冻保存和/或细胞类型对酶消化的敏感性诱导的细胞损伤。其次，该研究涉及数量样本有限，限制了基于图的聚类来解析某些细胞类型（例如DC或CD4 +与CD8 + TC）的能力，这也是其他scRNAseq皮肤研究共有的问题，还需要更大的队列进行验证。

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